【公開日：2024.07.25】【最終更新日：2024.06.12】

課題データ / Project Data

課題番号 / Project Issue Number

23CT0071

利用課題名 / Title

³¹P NMRを用いたリン脂質の定量分析法

利用した実施機関 / Support Institute

公立千歳科学技術大学 / Chitose IST

機関外・機関内の利用 / External or Internal Use

外部利用/External Use

技術領域 / Technology Area

【横断技術領域 / Cross-Technology Area】（主 / Main）計測・分析/Advanced Characterization（副 / Sub）-

【重要技術領域 / Important Technology Area】（主 / Main）次世代バイオマテリアル/Next-generation biomaterials（副 / Sub）-

キーワード / Keywords

核磁気共鳴/ Nuclear magnetic resonance

利用者と利用形態 / User and Support Type

利用者名（課題申請者）/ User Name (Project Applicant)

樋口 央紀

所属名 / Affiliation

株式会社機能性植物研究所

共同利用者氏名 / Names of Collaborators in Other Institutes Than Hub and Spoke Institutes

ARIM実施機関支援担当者 / Names of Collaborators in The Hub and Spoke Institutes

利用形態 / Support Type

（主 / Main）機器利用/Equipment Utilization（副 / Sub）-

利用した主な設備 / Equipment Used in This Project

CT-005：核磁気共鳴装置（NMR）

報告書データ / Report

概要（目的・用途・実施内容）/ Abstract (Aim, Use Applications and Contents)

　リン脂質は、両親媒の性質を有することから主に細胞の膜脂質として存在している。膜脂質は活性酸素などによる酸化、過酸化反応により酸化、過酸化され、これが生体の老化等に関与することが示唆されている。このことから、リン脂質の分析は重要であり、特にリン脂質のクラス分析（PC、PE、PS、PG、PI、CLなど）の需要が高くなっている。リン脂質は特異的な発色団、官能基、蛍光などを有していないことから、一般的な定量が難しい。これまでにTLC法、HPLC-UV法、HPLC-RI法、HPLC-ELSD法が用いられてきた。TLC法は、TLCにより各リン脂質を分離し、検出、定量する方法であるが、TLCの操作に経験が必要であり、再現性が難しい。また、各種HPLC法では、使用できる溶媒が限られ、検出感度も低い。また、ELSDなどの特殊な装置を使用する必要がある。近年では、HPLC-ESI-MS/MSによるリン脂質の網羅的な分析手法もあるが、定量のための標準品がすべて網羅できない点、イオンサプレッションによる定量精度の問題などがあり、いずれも課題の多い分析方法である。
　本課題では、リン核一次元核磁気共鳴スペクトル（³¹P-NMR）によるリン脂質クラスの定量方法（NMR溶媒の検討、pH、温度条件の最適化など）を検証し、測定時間、測定精度、分析コストなどについて検討する。

実験 / Experimental

１．試料および試薬等
（１）試料
　測定試料として、凍結乾燥したホタテの乾燥粉末、各種リン脂質（PC、PE、PS）、標準試料として卵由来レシチン（富士フィルム和光純薬）を使用した。
（２）試薬及び標準試薬
　試薬および標準試薬は、以下を使用した。
　コール酸・Na（東京化成工業）、EDTA・2Na（同仁化学研究所）、重水 99.8%（富士フィルム和光純薬）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（富士フィルム和光純薬）、O-ホスホ-L-セリン標準物質（富士フィルム和光純薬）
２．溶液の調製方法等
（１）1M Tris-HCl緩衝液（pH7.0）
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン12.1gを秤量し、イオン交換水約20mLで溶解させ、6M塩酸でpHを7.0に調製した。pH調製後、イオン交換水で100mLにメスアップした。
（２）EDTA溶液
　EDTA・２Na２を2.5g秤量し、1M Tris-HCl緩衝液（pH7.0）25mLに溶解した。
（３）20%界面活性剤溶液
　コール酸ナトリウムを2g秤量し、重水10mLに溶解した。
（４）内部標準溶液
　ホスホセリン20mgを秤量し、EDTA溶液2mLに溶解した。
３．試験溶液の調製
　ホタテの総脂質抽出物、レシチンを10mg秤量し、20%界面活性剤溶液を１mL、内部標準溶液１mLを添加した。窒素置換後、50℃、1時間インキュベートした。インキュベート後、0.7mLをNMR試料管（φ5mm）に添加し、NMR測定用サンプルとした。
４．NMRの測定、解析方法
　³¹P-NMRの測定方法は、プローブ温度：30℃、待ち時間：2sec、取込時間：4sec、ダミースキャン：4回、積算回数：512回とした。
　解析方法は、内部標準物質として使用した、ホスホセリンの化学シフト値を、4.54ppmとして、各リン脂質クラスを同定した。

結果と考察 / Results and Discussion

１．結果
　ホタテの総脂質抽出物、各種リン脂質、卵黄レシチンについて、³¹P-NMRを測定した。内部標準であるホスホセリン（PSER）のピークの化学シフト値をδ4.54ppmに設定した。ホタテの総脂質、各種リン脂質では、PC、PE、PSのピークを確認することができた。また、卵黄レシチンについても、PC、PEのピークを確認することができた。
２．考察
　³¹P-NMRの測定によって、PC、PE、PS等のピークを確認した。ホタテの総脂質抽出物では、PC、PE、PSのピーク面積から内容量を試算することができた。しかし、標準品として使用したリン脂質の内容量と差異が認められたため、今後、検討が必要と考えられた。今後の予定として、定量値の精度、他のサンプルでの測定について検討する予定である。

図・表・数式 / Figures, Tables and Equations

その他・特記事項（参考文献・謝辞等） / Remarks(References and Acknowledgements)

成果発表・成果利用 / Publication and Patents

論文・プロシーディング（DOIのあるもの） / DOI (Publication and Proceedings)

口頭発表、ポスター発表および、その他の論文 / Oral Presentations etc.

特許 / Patents

特許出願件数 / Number of Patent Applications：0件
特許登録件数 / Number of Registered Patents：0件