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文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム 平成28年度秀でた利用成果
神経変性疾患の発症に関わるタンパク質ミスフォールディング
慶應義塾大学理工学部 古川 良明,安齋 樹
自然科学研究機構 分子科学研究所 秋山 修志,向山 厚

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(左から) 慶應義塾大学理工学部 古川 良明,安齋 樹,分子科学研究所 秋山 修志,向山 厚


1.はじめに

 多くのタンパク質は,新生ポリペプチド鎖としてmRNAから翻訳された後に,天然構造と呼ばれる個々にユニークな立体構造を構築することで,その生理機能を発揮する.タンパク質が天然構造を獲得するまでの「フォールディング」と呼ばれるプロセスは,生体内におけるタンパク質機能の発現制御を理解する上で非常に重要である.一方で,アミノ酸変異や様々な環境変化が引き金となって,タンパク質がその天然構造を構築できずに異常な立体構造を形成することがある.このプロセスは「ミスフォールディング」と称され,タンパク質の機能喪失や新たな毒性獲得などを通じて,アルツハイマー病やアミロイドーシスといったコンフォメーション病と呼ばれる様々な疾患の発症に関わると考えられている[1].よって,ミスフォールド型タンパク質の構造・物性を明らかにすることができれば,疾患の発症メカニズムの解明,ひいては,治療・予防法開発へと応用的に展開することが可能となるはずである.

 実際,タンパク質フォールディング・ミスフォールディングに関する研究は精力的に進められているものの,発症に関わるミスフォールド構造については,多くの疾患において不明なままであるのが現状であると私たちは考えている.なぜなら,タンパク質のフォールディングは天然構造と言う単一の構造へと「収斂」していくプロセスであるのに対して,ミスフォールディングは天然構造ではない構造への「発散」と考えることができ,ミスフォールド構造はほぼ無限にあるといっても過言ではないからである.例えば,精製タンパク質を非生理的な溶液条件(化学的変性剤の添加や溶液pHの変化)におくことでミスフォールドさせ,その構造・物性についての詳細な評価がなされているが,それらが患者の体内で実際に生じるミスフォールド構造と同一であるのかは定かでない.つまり,コンフォメーション病の病理にタンパク質ミスフォールディングが果たす役割を明らかにするためには,我々の体内で進行しうるミスフォールディングの経路を見極める必要があると考えられる.

 私たちの研究グループでは,Cu/Zn-superoxide dismutase(SOD1)というタンパク質に着目し,疾患の発症に関わるミスフォールディングについてタンパク質科学的・病理学的な研究を進めている.SOD1は筋萎縮性側索硬化症(ALS)で最初に同定された責任遺伝子で[2],150種類以上の病因性変異が現在までに報告されている[3].ALSは重篤な筋萎縮を主症状とする神経変性疾患で,脊髄運動ニューロンが選択的に変性・脱落することが知られているものの,その病理については未だ不明な点が多く,予防・治療法は確立していない.モデル動物を利用したALS病理の研究は比較的多く[4],マウスに変異SOD1タンパク質を発現させることでALS様の症状を再現できるのに対して[5],SOD1遺伝子をノックアウトしたマウスはALS様の症状を呈さないことが報告されている[6].よって,変異に伴うSOD1の生理機能低下がALSを発症させる要因ではなく,神経毒性につながる新たな物性をSOD1が変異によって獲得すると考えられている.特に,ALSの病変部位である脊髄運動ニューロンには変異SOD1が異常に蓄積していることからも[7],変異によるSOD1のミスフォールディングが毒性の発揮に関与しているのではないかと提案されている.

 SOD1はホモ二量体で,各々のサブユニットに銅・亜鉛イオンが結合し,分子内ジスルフィド(S-S)結合が形成することで,非常に安定な天然構造へとフォールディングするタンパク質である(図1).しかし,病因性変異によって,金属イオンとの親和性や分子内S-S結合の安定性が低下し[8][9],SOD1の構造はミスフォールドすることが提案されている.特に,私たちの研究グループでは,ALSのモデルマウスが疾患を発症すると,SOD1がS-S結合でクロスリンクされた異常なオリゴマー(S-Sオリゴマー)が形成することを初めて見いだしている[10].そこで,タンパク質分子レベルでのALS病理を理解するためには,S-Sオリゴマーの構造や形成メカニズムを明らかにする必要があると考え,タンパク質構造・物性解析のための研究設備が充実している分子科学研究所と共同研究を開始するに至った.なかでも特に,文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業(分子・物質合成プラットフォーム)として利用が可能である円二色性分光装置(CD),及び,X線小角散乱装置(SAXS)を通じて(図2),ミスフォールド型SOD1の溶液構造を明らかにした(詳細な実験内容・結果については,[11]を参照されたい).


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図1 SOD1のX線結晶構造(PDB ID: 1HLA) SOD1は,銅イオン(青色),及び,亜鉛イオン(赤色)を結合し,サブユニット内にS-S結合(黄色)を形成することで機能を発揮する.通常はS-S結合の形成に関与しないCys6/Cys111(橙色)についても示した.


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図2 (左)円二色性分光装置(CD),(右)X線小角散乱装置(SAXS)


2.実験結果・考察

2.1 示差走査熱量分析(DSC)によるSOD1の熱変性解析

 In vitro/in vivoのいずれの条件においても,ALS変異の導入に伴ってSOD1と金属イオンとの親和性が低下することが報告されている[8][12][13].そこで,ALS変異の一つであるG37R変異を有したSOD1を作製し,銅・亜鉛イオンを結合していないアポ型タンパク質の示差走査熱量分析を行うことで,SOD1の熱変性について評価した.その際,熱変性によってS-S結合によるクロスリンクが生じないように,SOD1のS-S結合に関与するCys残基(Cys57/Cys146)以外の2つのCys残基(Cys6/Cys111)をSerに置換したpSOD1を使用して実験を行った(図1).既に報告されているように[14],アポ型pSOD1の融点(変性中点,Tm)はG37R変異が導入されることで低下し,タンパク質の熱安定性が低下することが確認されたものの,サーモグラムをより詳細に検討すると,観察される吸熱ピークが左右対称の形状をしておらず(図3A),アポ型pSOD1の熱変性は天然状態(F状態)と変性状態(U状態)の単純な二状態転移(FU)では説明できなかった.代わりに,中間的な状態(I状態)が熱変性過程において存在すると考えることで実験結果をうまく説明することができた(FIU).特に,生理的温度である37℃付近では,pSOD1の大部分がF状態にあると考えられるのに対して,G37R変異型pSOD1では状態転移を示唆する吸熱が既に始まっており(図3A),I状態として存在していることが示唆された.


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図3 アポ型pSOD1の熱変性 (A)pSOD1(○),及び,G37R変異型pSOD1(●)のDSC測定により得られたサーモグラム.点線はガウス曲線によるフィットを示す.(B)G37R変異型pSOD1のCDスペクトルの温度変化.10℃から60℃まで温度を変化させてスペクトル測定を行った.20℃,及び,37℃で得られたCDスペクトルを,それぞれ青色,赤色で示した.


2.2 円二色性分光(CD)を利用したSOD1の二次構造解析

 DSC測定により得られた結果をもとにすると,ALS変異が導入されたアポ型SOD1は,生体内環境(37℃)においてI状態にミスフォールドしていることが考えられた.そこで,タンパク質の二次構造情報を得ることができるCDスペクトルを測定し,G37R変異型pSOD1のI状態の構造について検討した.比較的低い温度(20℃付近)では,210nm付近に負のピークを示すCDスペクトルが得られ,β-シートに富んだ構造の形成が確認された(図3B青).しかし,溶液の温度を上昇させて37℃付近にすると,β-シートに特徴的な210nm付近のCDシグナルは消失し,ランダムコイル構造に見られる200nmの負のピークを示すCDスペクトルに変化した(図3B赤).よって,変異型SOD1が37℃付近で形成するI状態においては,二次構造がほぼ消失していると考えられるものの,DSCにより得られるサーモグラムが示すように,溶液の温度をさらに上昇させることで,いわゆる変性状態(U状態)への転移を示す吸熱過程が観察される(図3A).つまり,I状態は二次構造を消失した状態ではあるものの,U状態とは異なることが示唆されるが,37℃で優勢に存在するI状態とは,いったいどのような構造をしているのだろうか?


2.3 X線小角散乱(SAXS)によるSOD1のコンフォメーション解析

 そこで,タンパク質の溶液構造に関する情報を提供するSAXSを利用し,I状態のコンフォメーション(タンパク質の形状)の検討を行った.具体的には,G37R変異型pSOD1の散乱曲線を10℃から60℃まで溶液温度を変化させて測定し,各々の散乱曲線についてギニエ解析を行うことで,各温度における慣性半径Rg,ならびに,相対分子質量Mrを算出した.その結果,溶液温度が40℃以下で得られるRgは20.9Åで,SOD1の天然状態の結晶構造から計算される値とほぼ同一であった(図4A).また,Mrはおよそ32,000と計算され,SOD1(分子量:16,000)の天然状態がホモ二量体として存在することと一致した(図4B).一方で,溶液温度が40℃以上になると,Rgは増大し,Mrは減少することから,G37R変異型pSOD1がU状態へ熱変性していることが確認できた(図4A,B).つまり,37℃におけるSOD1のI状態は,二次構造が消失しているものの,天然構造とほぼ同じRgを有したコンパクトな構造で,ホモ二量体として存在することが考えられた.実際,37℃で測定した散乱曲線のクラツキープロットにも極大が確認されることから(図4C),I状態にあるG37R変異型pSOD1はコンパクトな構造を有していることが示唆された.


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図4 SOD1コンフォメーションの温度変化 (A,B)各温度において得られたpSOD1(黒),及び,G37R変異型pSOD1(赤)の散乱曲線に対してギニエ解析を施すことで得られる(A)慣性半径Rg,及び,(B)相対的分子質量Mrを示した.(C)各温度におけるG37R変異型pSOD1の散乱曲線のクラツキープロットを示した.(D)アポ型のG37R変異SOD1を,ゲル上部に示した温度で16時間静置した後に,SDS-PAGEによる解析を行った.


2.4 SOD1のS-Sオリゴマー形成メカニズム

 生理的な温度条件である37℃において,ALS変異を有したアポ型SOD1はI状態として存在し,天然構造とほぼ変わらないコンパクトな全体構造を有していたものの,二次構造含量が大きく低下した状態であることが分かった.そこで,全てのCys残基を有した本来のSOD1を用いて,アポ型のG37R変異SOD1を37℃に静置したところ,S-S結合でクロスリンクされたS-Sオリゴマーを容易に形成することが分かった(図4D).一方で,溶液温度を30℃以下にすることでF状態を優勢にすると,オリゴマー形成が認められなくなった(図4D).私たちのグループでは,SOD1のミスフォールディングに伴って,S-S結合形成に通常は関与しない2つのCys残基(Cys6/111)が,分子内S-S結合を形成するCys57/146を求核攻撃し,S-S結合がシャッフルするメカニズムを提唱してきた[15].実際,結晶構造に代表されるようなF状態では,Cys6/111はCys57-Cys146のS-S結合から距離的に離れており,シャッフルが生じるような求核攻撃を可能にするような位置関係にはない(図1).しかし,変異の導入に伴って,二次構造含量が低下したI状態へと移行することで,S-S結合のシャッフルが分子内・間で可能となり,S-Sオリゴマーが形成するのではないかと推察された.つまり,本研究で見いだしたI状態はSOD1オリゴマー化の前駆体ではないかと考えられた.


2.5 ALS病理において見られるS-Sオリゴマー

 さらに私たちは,SOD1のS-Sオリゴマー形成が,試験管内だけでなく生体内環境においても進行し,ALSの発症に関与するのかについても研究を進めている.特に近年には,試験管内にて作製したS-Sオリゴマーを抗原としてウサギを免疫することで,S-Sオリゴマーを特異的に認識する抗体(S-Sオリゴマー抗体)を作製・精製することに成功した[16].私たちのS-Sオリゴマー抗体は非常に認識特異性が高く,SOD1のフォールド型はもちろんのこと,酸や変性剤で変性させたSOD1,及び,不溶性の凝集体とは反応せず,可溶性のS-Sオリゴマーのみを認識することが分かった.そこで,S-Sオリゴマー抗体を用いて,ALSモデルマウスやALS患者におけるS-Sオリゴマーの免疫化学的検出を試みたところ,病変が限定的である小脳や脊髄後角領域では免疫化学的なシグナルが検出されなかった一方で,主要な病変部位である脊髄運動ニューロンにはS-Sオリゴマーの形成が認められた(図5).また,脊髄に検出されるS-Sオリゴマー量は病期の進行に伴い増加したことから(図5),変異SOD1のオリゴマー化がALSの発症に関与していることが考えられた.


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図5 生体内におけるS-Sオリゴマーの形成とALS (A)G93A変異SOD1を発現させたALSのモデルマウスから,腰髄(赤色),頚髄(緑色),脳幹(青色),及び,小脳(灰色)を取り出してホモジナイズし,S-Sオリゴマー抗体を用いたサンドウィッチELISAによってS-Sオリゴマーの検出を行った.各々の組織において,30日齢でのデータに対する統計的有意性についても示した(**: P<0.01).(B)SOD1遺伝子にC111Y変異を有するALS患者の腰髄(前角領域)切片をS-Sオリゴマー抗体で免疫染色したもの.運動ニューロン内に染色が認められ,S-Sオリゴマーの形成が示唆される.


3.結論

 本研究において,ALS変異型のSOD1は,金属イオンとの親和性が低下し,高い構造安定性を失うことで,生理的環境ではI状態として存在することが示された.さらに,変異型SOD1のI状態は,天然構造にみられるような非常にコンパクトなホモ二量体としての形状を維持しているにもかかわらず,二次構造含量が大幅に低下しており,システイン残基の間でS-S結合がシャッフルし,S-Sオリゴマーが容易に形成しうる状態にあることが示唆された(図6).また,ALSの病期が進むにつれて,S-Sオリゴマーが病変部位である脊髄運動ニューロンに蓄積していくことから,S-Sオリゴマーの形成はALS病態に関連したSOD1のミスフォールディング経路であることが考えられた.現在は,これらの知見をもとにして,変異SOD1におけるFからIへの状態転移,ならびに,S-Sオリゴマーの形成過程をターゲットとすることで,疾患に関連したミスフォールディング経路を抑制できる薬剤の開発を進めている[17].


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図6 本研究で提案するSOD1のミスフォールディング経路 アポ型の変異SOD1は,生理的温度(37℃)付近ではI状態として存在し,S-S結合が分子内・間でシャッフルしやすい状況にあると考えられる.S-S結合がシャッフルすることでS-Sオリゴマーが形成し,ALSの発症や病態の進行に寄与していることが推察される.


謝辞

 本研究において中心的な役割を果たした実験手法であるCD,及び,SAXSの測定については,文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業(分子科学研究所 分子・物質合成プラットフォーム)からの支援を受けて実施された.また,DSCを用いた熱変性の評価についても,分子科学研究所の共同利用を通じて得られた成果である.実施機関(分子科学研究所)の担当者である秋山 修志教授,及び,向山 厚助教には,装置の扱い方や測定手法はもちろんのこと,サンプル調製に関する指導から,具体的なデータ解析に至るまで,手取り足取りのお世話になった.特に,SAXSについては,単なる装置利用に留まらず,有効的かつ友好的な共同研究として大いに勉強させて頂いた.また,モデルマウスのサンプルは,名古屋大学環境医学研究所の山中 宏二教授,慶應義塾大学薬学部の三澤 日出巳教授に,ALS患者のサンプルについては,まつもと医療センター神経内科の大原 慎司副院長に提供して頂いた.この場を借りて深謝する次第である.


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(慶應義塾大学理工学部 古川 良明)


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